Testmethoden

Der Nachweis von Viren nach Vermehrung in der Zellkultur stellt ein verbreitetes Verfahren in der virologischen Labordiagnostik dar. In unserem Labor werden zu diesem Zweck rund 20 verschiedene Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs (Tierspezies, Organherkunft) routinemäßig gehalten. Zum Nachweis viraler Krankheitserreger werden die eingesandten Proben zunächst aufgearbeitet (u. a. Herstellung von Suspensionen aus Organproben, Präparation von Zellen aus gerinnungsgehemmten Blutproben oder Tupferproben) und dann zur Inokulation von Testkulturen eingesetzt. Die Auswahl der verwendeten Zelllinien richtet sich nach der Herkunft des Untersuchungsmaterials und der diagnostischen Fragestellung. Die Vermehrung von Viren in Kulturzellen geht häufig mit einem zytopathischen Effekt (zpE), d. h. einer morphologischen Veränderung der Zellen bzw. des Zellrasens, einher. Wird ein zpE beobachtet erfolgt die weitere Charakterisierung des Virus z. B. durch Immunfluoreszenz, PCR oder Elektronenmikroskopie. Unter Umständen sind mehrere "blinde" Passagen notwendig bis ein zpE auftritt. Einige Viren vermehren sich in der Zellkultur ohne zpE, z. B. nicht zytopathogene (nzp) Vertreter des Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV). Nzp BVD-Viren werden routinemäßig durch Immunfluoreszenz unter Verwendung der Testkulturen nachgewiesen. 

Vorteile: je nach Empfänglichkeitsspektrum der eingesetzten Zellen kann eine breite Palette viraler Erreger nachgewiesen werden. 

Nachteile: hoher apparativer Aufwand und lange Dauer des Verfahrens. Für einige Viren steht kein Zellkultursystem zur Verfügung.

Die Viro Vet Diagnostik verfügt über ein eigenes Elektronenmikroskop (EM), welches schwerpunktmäßig in der virologischen Infektionsdiagnostik eingesetzt wird.

Vertreter zahlreicher Virusfamilien lassen sich elektronenmikroskopisch unterscheiden. Ein schnelles Verfahren zur Darstellung und morphologischen Charakterisierung von Viruspartikeln in Suspension stellt die Negativkontrastierung dar. Unter anderem kann der Nachweis einer Virusinfektion direkt aus Probenmaterial erfolgen. Außerdem lassen sich Viruspartikel nach Vermehrung in Zellkulturen identifizieren. Voraussetzung für einen erfolgreichen Virusnachweis ist eine hohe Zahl von Viruspartikeln in dem zu untersuchenden Material.
Sehr kleine Viruspartikel (z.B. Parvoviridae) sind selbst im EM schwer zu detektieren. Hier macht man sich das Prinzip der Immunelektronenmikroskopie zu Nutze, bei der Viruspartikel durch (gold)markierte Antikörper vernetzt werden und so besser sichtbar werden.
Vorteile: kann verschiedene Erreger gleichzeitig detektieren
Nachteile: große Virusmenge / bestimmtes Ausgangsmaterial nötig, hoher apparativer Aufwand.

Indikationen für den Einsatz der elektronenmikroskopischen (EM) Virusdiagnostik sind u.a. virale Darmerkrankungen und virusinduzierte Haut- und Schleimhautveränderungen. Anwendungsbeispiele für die EM Diagnostik sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

Die indirekte Immunfluoreszenz kann für den Nachweis von Antikörpern gegen Virusantigene aus Patientenseren eingesetzt werden. Dabei werden mit einem bekannten Virusisolat infizierte Testzellen mit dem fraglichen Serum inkubiert und die Bindung von Antikörpern aus dem Serum mittels eines Fluorochrom markierten Sekundärantikörpers detektiert. Die indirekte Immunfluoreszenz findet u. a. beim Nachweis von Antikörpern gegen das feline Coronavirus (FCoV, u.a. Erreger der felinen infektiösen Peritonitis (FIP)), gegen das Virus der Bornaschen Krankheit bei Säugern (BoDV) und gegen aviäre Bornaviren (v.a. PaBV) Anwendung.

Vorteile: schnelles Verfahren mit hoher Sensitivität.

Nachteile: hoher apparativer Aufwand, unspezifische Reaktionen möglich (abhängig vom Untersuchungsmaterial und der Qualität der Antikörper).

Die VVD nutzt einen Kompetitions-ELISA zum Nachweis von Antikörpern in Schaf- und Ziegenproben gegen CAEV/MVV. Die Vertiefungen der ELISA-Testplatten sind hierbei mit inaktiviertem CAEV-Antigen beschichtet, welches Antikörper spezifisch bindet. Einmal gebundene Antikörper verhindern anschließend die Bindung eines weiteren, Enzym (HRP)-gekoppelten spezifischen monoklonalen Antikörper gegen CAEV Antigen. Das Enzym des gebundenen monoklonalen Antikörpers würde mit einem zugegebenen Substrat zu einem sichtbaren Farbumschlag führen, gebundene Antikörper aus Patientenseren verhindern diesen Farbumschlag. Die Farbintensität steht bei einem solchen Kompetitionstest also im umgekehrten Verhältnis zur Antikörpermenge in der zu testenden Probe (Serum/Plasma oder Milch), wird mittels Photometer gemessen und mit entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen verglichen.
Vorteile: schnelles Verfahren mit hoher Sensitivität.

Nachteile: hoher apparativer Aufwand, unspezifische Reaktionen möglich (abhängig vom Untersuchungsmaterial und der Qualität der Antikörper).

Wir verwenden den Immunoblot zum Nachweis antiviraler Antikörper gegen das feline Immundefizienzvirus (FIV). Hierbei werden Proteine einer Viruspräparation entsprechend ihrer Größe mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Nachfolgend werden die aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran transferiert (geblotted).
Die fertige Membran wird mit dem Probenserum inkubiert. Nach Waschschritten erfolgt die Zugabe eines enzymmarkierten speziesspezifischen Antikörpers. Im Anschluss an eine weitere Inkubationszeit und Waschschritte wird die Membran mit einem Substrat inkubiert, welches das am sekundären Antikörper befindliche Enzym durch Chemilumineszenz sichtbar macht.
Vorteile: hohe Spezifität, Test daher geeignet, um positive Ergebnisse aus Schnelltests zu überprüfen.
Nachteile: hoher Zeit und Materialaufwand.

Bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) werden bestimmte Nukleinsäureabschnitte, zum Beispiel von Viren, vervielfältigt und später  nach ihrer Größe per Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend durch Anfärben sichtbar gemacht.
Die einzelnen Schritte einer PCR sehen wie folgt aus: doppelsträngige DNA wird im zuerst bei 94°C denaturiert, danach findet bei einer Temperatur von 50-60°C das Annealing (Anlagern der Primer) statt und im letzten Schritt wird mit Hilfe von Desoxyribonukleotiden und einer thermostabilen Polymerase bei 72°C eine Neusynthese des definierten DNA-Abschnittes durchgeführt. Diese 3 Reaktionsschritte werden solange hintereinander durchgeführt, bis durch die exponentielle Vervielfältigung eine messbare Menge des DNA-Fragmentes entstanden ist (etwa 30 Zyklen).
Primer sind kurze einzelsträngige DNA-Abschnitte, die zum Anfang und Ende der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind. Sie sind daher für jede PCR spezifisch und müssen vorher so ausgewählt werden, dass das gewünschte DNA-Produkt entsteht.
Für RNA-Viren muss der Schritt der reversen Transkription (RT) einer PCR vorangehen. Dabei wird die RNA in DNA umgeschrieben, damit die folgenden Schritte der PCR durchgeführt werden können.
Als Untersuchungsmaterial eignen sich virushaltige Sekrete/Exkrete (Punktat, Tupfer, EDTA-Blut, Liquor, Urin, Kot) und Organmaterial.
Die quantitative Echtzeit PCR beruht auf der Aussendung von Lichtsignalen während der Nukleinsäuresynthese. Hierbei korreliert die Menge der Lichtsignale mit der Menge der amplifizierten DNA und wird mit einer Standardverdünnungsreihe in Relation gebracht.
Vorteile: sehr geringe Mengen an DNA/RNA können nachgewiesen werden, hohe Sensitivität, schnelles Ergebnis, Nachweis von Viren, die nicht auf Zellkultur angezüchtet werden können.
Nachteile: hoher apparativer Aufwand, mögliche falsch negative Ergebnisse, falls ein Primer nicht genau zu einem DNA-Abschnitt passt.

Mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Antikörper lassen sich u. a. zum Nachweis viraler Antigene in Zellpräparationen (z.B. Zellen aus Nasentupfern) oder Zellkulturen (nach Virusanzucht) einsetzen. Der Nachweis erfolgt dabei entweder direkt (der antivirale Antikörper ist Fluorochrom-markiert) oder indirekt (die Bindung eines definierten, nicht markierten antiviralen Antikörpers wird mittels eines markierten Sekundärantikörpers (anti-Antikörper-Konjugat) nachgewiesen). In beiden Fällen zeigt das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals die Anwesenheit des gesuchten viralen Erregers an.
Vorteile: schnelles Verfahren mit hoher Sensitivität.
Nachteile: hoher apparativer Aufwand, unspezifische Reaktionen möglich (abhängig vom Untersuchungsmaterial und der Qualität der Antikörper).

Die Neutralisation von Viren kann zum Nachweis und zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper aus Seren ausgenutzt werden. Meist werden dafür Virusstämme eingesetzt, die einen zytopathischen Effekt hervorrufen, so dass der Test direkt mikroskopisch ablesbar ist. Werden nicht zytopathische Virusstämme verwendet (z.B. Tollwutvirus), muss im Anschluss eine Immunfluoreszenz zur Auswertung durchgeführt werden.
Für den Serumneutralisationstest wird eine Serumverdünnungsreihe hergestellt und mit einer definierten Virusdosis für eine bestimmte Zeit inkubiert. Nach Zugabe eines Indikatorsystems (Gewebekulturzellen) folgt eine Inkubationszeit von i.d.R. 3-5 Tagen (je nach Virus bis zu 8 Tagen). Mit Hilfe statistischer Verfahren kann der Titer an neutralisierenden Antikörpern errechnet werden. Eine Aussage über den Verlauf einer Infektion kann nur mittels gepaarter Serumproben getroffen werden, wofür im Idealfall beide Titer im gleichen Test bestimmt werden sollten. Eine Unterscheidung zwischen Impftiter und Infektionstiter kann mit diesem Test (auch bei Markerimpfstoffen) nicht durchgeführt werden. Angaben, ob die Titerhöhe vor einer Erkrankung schützt, können in vielen Fällen nicht gemacht werden.
Vorteile: hohe Spezifität und Sensitivität
Nachteile: Zeit-, Personal- und Materialaufwand, schlechte Standardisierbarkeit zwischen verschiedenen Labors aufgrund unterschiedlicher Testsysteme (Virusstamm, Zellsystem)

Der FAVN-Test ist ein Serumneutralisationstest und dient der Bestimmung des Antikörpertiters gegen Tollwutvirus. Dabei werden Verdünnungsreihen der zu testenden Seren mit einer konstanten Menge Testvirus inkubiert und anschließend empfängliche Kulturzellen hinzugegeben. In den zu testenden Seren enthaltene neutralisierende Antikörper können eine Infektion der Indikatorzellen verhindern. Die Vermehrung des Testvirus wird im FAVN-Test mit Hilfe der direkten Immunfluoreszenz nachgewiesen, da Tollwutviren zu den nicht zytopathogenen Viren gehören. Der Titer wird gemäß dem Verfahren nach Spearman-Kärber berechnet und als internationale Einheiten (IU) durch Vergleich mit einem international festgelegten Standard angegeben. Dieser Test findet Anwendung im Rahmen von Impftiterkontrollen und als vorgeschriebene Untersuchung bei bestimmten Reiseabsichten mit Hunden, Katzen oder Frettchen. Weitere Informationen diesbezüglich finden Sie hier.

Lösliches virales Antigen und antivirale Antikörper diffundieren in einem Agarmedium, wobei sich bei positiver Reaktion in der sogenannten Äquivalenzzone lichtstreuende Präzipitationslinien aus Antigen-Antikörperkomplexen bilden. Der Test kann entweder als Antigen- oder als Antikörpernachweis genutzt werden. Als "Coggins-Test" ist der Agargeldiffusionstest für den Antikörpernachweis der Infektiösen Anämie der Pferde vorgeschrieben. Hierbei werden Testseren alternierend mit positiven Kontrollseren aufgetragen, das Ergebnis kann nach 48 Stunden abgelesen werden.

 

 Einige Viren (z.B. Influenzaviren) sind in der Lage, Erythrozyten bestimmter Tierarten (u.a. von Hühnern) zu agglutinieren (Hämagglutination). Durch vorherige Inkubation des Virus mit Antikörpern kann die Hämagglutination gehemmt werden (Hämagglutinationshemmung, HAH).
Im HAH-Test werden Verdünnungsreihen der Testseren mit einer definierten Virusdosis inkubiert und anschließend Erythrozyten zugegeben. In der folgenden Inkubationszeit kann nicht durch Antikörper gebundenes Testantigen an Erythrozyten binden und es kommt zur Agglutination. In Anwesenheit HAH-Antikörper bleibt die Agglutination aus. Nicht agglutinierte Erythrozyten sedimentieren zügig und sind makroskopisch als rote "Knöpfe" am Boden der Vertiefung zu erkennen. Der Titer an HAH-Ak wird als der Wert der Serumverdünnung angegeben, bei der noch eine vollständige Hemmung der Hämagglutination auftritt.